Nachdem der Bösewicht Shredder bei seinem letzten Kampf mit den Turtles entkommen konnte, verfolgt er weiterhin akribisch seine finsteren Pläne. Dabei soll ihm ein von dem leicht schrägen Wissenschaftler Baxter Stockman (T. Perry) entwickeltes Serum helfen, dass Menschen in mutierte Tiere verwandeln kann – oder auch mutierte Tiere in Menschen, womit sich den vier in der Kanalisation lebenden Superhelden erstmals die Chance bieten könnte, im Tageslicht unter Menschen zu wandeln. Doch zuvor muss April (M. Fox) die Zeuge von Shredders Überfall auf Stockmans Labor wird, erst einmal mit dem Serum entkommen. Glücklicherweise bekommt sie dabei Hilfe vom Hockeymasken tragenden Casey (S. Amell), der selbst gern ein Superheld wäre und des Nachts mit einem Hockeyschläger bewaffnet auf Verbrecherjagd geht. Gemeinsam mit den Turtles nehmen sie den Kampf gegen Shredder, zwei seiner mutierten Schergen, Rocksteady (S. Farrelly) und Bebop (G. A. Williams), und den außerirdischen Kriegsherren Krang, der ebenso die Menschheit unterjochen will, auf. Doch hat die kleine Gruppe überhaupt eine Chance gegen die übermächtige Armee des Bösen?